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Investigacion de Parc Tauli

TÍTULO:
Síndrome de Angelman: identificación de nuevas alteraciones genéticas mediante secuenciación del exoma y descripción de perfiles conductuales

 

RESUMEN
El síndrome de Angelman (SA) es una enfermedad neurogenética causada mayoritariamente por mutaciones o deleciones del gen UBE3A en el alelo materno. Existe un grupo de pacientes (10- 15%) que presentando un fenotipo clásico de SA aún no se conocen las bases moleculares. El objetivo principal de este proyecto es avanzar en el conocimiento de la etiopatogenia del fenotipo SA sin diagnóstico molecular. Se pretende identificar nuevos gen/genes responsables del
fenotipo SA y describir su perfil conductual. Se determinará si existe una vía molecular común entre los genes involucrados en el SA como base fisiopatológica para llegar a establecer un diagnóstico, un pronóstico y un tratamiento.


Mediante la secuenciación masiva se secuenciará el exoma en trios paciente-progenitores. Esta tecnología permite la detección de variantes patológicas tipo SNVs (single nucleotid variant) o CNVs (copy number variant) que serán confirmadas por secuenciación Sanger y multiplex ligation dependent probe amplification, respectivamente. Se analizarán los resultados a través de distintos softwares específicos para la identificación de redes génicas. Se aplicarán distintos cuestionarios neuropsicopatológicos para determinar el perfil conductual y las habilidades en los pacientes con una nueva mutación y se comparan con el grupo sin mutación y con el grupo de pacientes con alteración en UBE3A


La CSPT es centro referente de las Asociaciones de SPW y de SA y dispone de una amplia cohorte de pacientes. Este estudio proporcionará información para establecer un nuevo algoritmo de diagnóstico genético, una correlación genotipo-fenotipo, recomendaciones más tempranas para el manejo cognitivo/conductual y proporcionar nuevas dianas genéticas para futuros tratamientos farmacológicos.

 

INTRODUCCIÓN
El síndrome de Angelman (SA) es una enfermedad neurogenética mapada en la región 15q11-q13 sujeta a impronta genómica, que está causada por un déficit de expresión del gen UBE3A en el alelo materno. Su prevalencia es de aproximadamente 1/15.000 nacimientos y clínicamente es característico un déficit intelectual grave con ausencia del habla, rasgos craneofaciales dismórficos distintivos como la microcefalia y macrostomia, problemas neurológicos de ataxia y/o
temblores en las extremidades y crisis epilépticas con anomalías específicas del electroencefalograma que persisten hasta la edad adulta. El fenotipo conductual se caracteriza por apariencia feliz, hiperactividad, déficit de atención y es frecuente la alteración de los ciclos del sueño [1-3].


La región cromosómica 15q11-q13 incluye un cluster de genes de expresión diferencial dependiente del origen parental. Los genes MKRN3, MAGEL2, NDN, PWRN1, C15orf2 y SUNRF-SNRPN con más de 70 snoRNAs C/D box son activos en el alelo paterno, mientras que en el alelo materno se produce su inactivación a través de la metilación de las regiones promotoras de cada gen. Hay dos genes de expresión materna, UBE3A y ATP10 que en el alelo paterno son silenciados mediante la síntesis de un tránscrito antisentido del gen SNURF-SNPRN. La ausencia de expresión materna del gen UBE3A específica de cerebro y cerebelo causa el SA. El gen ATP10 se consideró un posible candidato pero no se han hallado evidencias de esta relación.


La pérdida funcional de UBE3A en el alelo materno se origina a través de diferentes mecanismos genéticos: a) deleción de la región 15q11-q13 en el 70-75% de los casos, b) mutaciones en UBE3A en el 10-15% de los casos, c) disomía uniparental paterna en el 1-3% de los casos SA y d) defecto de la impronta genómica en el 2-4% de los casos. Alrededor de un 10-15% de los pacientes presentan una clínica característica de SA, pero se desconoce aún la causa genética
[4]. A excepción de algunos casos familiares por mutación en UBE3A o microdeleción en el centro de impronta, la mayoría son de novo .


Hay una gradación en la gravedad del fenotipo según sea la causa genética, siendo más grave en las deleciones, seguida de las mutaciones en UBE3A y de los casos SA de etiología desconocida, y de menor gravedad en la disomía uniparental paterna y en el defecto de impronta. El fenotipo causado por una mutación en el gen UBE3A se caracteriza por una mayor incidencia de crisis epilépticas y microcefalia versus los casos con disomía uniparental. En cambio, el fenotipo neurocognitivo de habilidades para la comunicación es mejor que en los casos con deleción [5]. En un estudio con una muestra de población española se describe, además, unperfil específico de habilidades adaptativas, con mejores puntuaciones en capacidad de autonomía personal y mayores dificultades en comunicación y habilidades motrices en los pacientes con mutaciones en UBE3A [6].


El desarrollo neuronal en pacientes SA se ve gravemente comprometido por el déficit de proteína E6-AP (E6-Associated Protein) codificada por UBE3A en neuronas del hipocampo, células de Purkinje y neuronas corticales. La proteína E6-AP, de la familia E3 ligasa de ubiquitinas, actúa en la vía de degradación proteica, siendo importante para el reconocimiento del sustrato y transferencia de ubiquitina a la proteína diana que ha de ser degradada. La ausencia de proteína E6-AP provoca un acúmulo de proteínas no degradadas. En el 10-15% de los casos SA de etiología desconocida se propone que la causa genética pueda ser debida a anomalías en proteínas diana de E6-AP que no serían reconocidas para ser degradadas y por tanto podrían acumularse y generar el fenotipo SA [7]. En la actualidad se han propuesto varios substratos (p53, p27, Pbl/Ect2, alfa-sinucleinas, Arc, efexina-5 y Rpn10) de la proteína E6-AP en el cerebro,
implicados en varios procesos como el crecimiento neuronal, migración en el córtex cerebral, control de los niveles AMPAR de superficie, control del número de sinapsis excitatorias y densidad de las espinas dendríticas [8, 9]. La función de E6-AP no es solo regular la degradación y el recambio proteico sino que además regula la transcripción de algunas proteínas como los receptores de hormonas esteroideas glucocorticoides. Cuando las vías de señalización de los receptores se interrumpen, se altera el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal incrementando la susceptibilidad al stress y a la ansiedad [10] e induciendo problemas cognitivos en los ratones SA [11]. Recientemente se ha descrito una nueva función de E6-AP en la alteración de la homeostasis, derivada por una disminución de la Acidificación del aparato de Golgi. Un pH elevado se asocia con una reducción importante de la sialización proteica alterando el proceso postraduccional del gen UBE3A, siendo éste un posible mecanismo subyacente al déficit del neurodesarrollo y de la plasticidad asociada al SA [12]. Existe pues un gran abanico de vías
génicas neurales interaccionado con UBE3A, por lo que un déficit en algún punto de esta red podría provocar alteraciones cerebrales que mimeticen el fenotipo SA.


Se conocen algunos síndromes con fenotipo similar al SA causados por mutaciones en genes con funciones superponibles a UBE3A como el de Christianson o SA-like ligado al X, causado por mutaciones en el gen SLC9A6, que controla la homeostasis iónica organelar. Una desregulación de la proteína NHE6 compromete la función lisosómica-endosómica neuronal causando una discapacidad intelectual grave, epilepsia, comportamiento autista y ataxia [13]. Otras entidades con fenotipo SA son debidas a mutaciones en el gen MECP2 involucrado en laregulación epigenética de UBE3A [14] y mutaciones en el gen HERC2 que interacciona con E6- AP estimulando su actividad ubiquitin ligasa [15]. Asimismo, se conocen variantes en número de copia con fenotipo SA: deleción 22q13 [16] y deleción 2q23.1 [17]. 

Actualmente, las variantes en número de copias y mutaciones puntuales del genoma responsable de la variabilidad interindividual pueden ser analizadas mediante la tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS). La NGS es una herramienta efectiva para identificar las variantes de un único nucleótido (SNV) con una sensibilidad y especificidad del 90%, con un 30% de especificidad para detectar inserciones/deleciones y del 70 % para reorganizaciones
estructurales, y una sensibilidad difícil de estimar debido al desconocimiento del número verdadero de variantes [18]. Existen cuatro estrategias principales para la detección de puntos de rotura a partir de datos de NGS: paired-reads, read-depth, split-read y clip-read análisis y sequence assembly [19-20]. Todas las estrategias tienen sus limitaciones siendo imposible la detección de todo tipo de alteraciones usando únicamente una de ellas. Como ejemplo podemos decir que mediante paired-reads y si lo combinamos con un análisis de split-reads podríamos detectar con una mayor eficacia determinadas reorganizaciones cómo inversiones, inserciones y deleciones. Para la detección de variaciones en número de copia sería aconsejable el uso de un análisis de read-depth.

En la actualidad los estudios de secuenciación exónica han revelado genes causales de algunos síndromes mendelianos del neurodesarrollo hasta ahora con una etiología genética desconocida. El síndrome de Kabuki se ha asociado a mutaciones en el gen MLL2 [21], el síndrome de Schinzel-Giedon a mutaciones que afectan a residuos de aminoácidos dentro de un dominio del gen SETBP1 altamente conservado y con un efecto deletéreo [22]. También se han descrito
mutaciones en los genes ASXL1 y KAT6B responsables de los síndromes de Bohring-Opitz [23] y de Say-Barber-Biesecker-Young-Simpson [17, 23], respectivamente. En los desórdenes del neurodesarrollo de base genética es más probable detectar mutaciones de novo que variantes heredadas y se hipotetiza que los desórdenes del neurodesarrollo comparten algunas bases genéticas y bases patológicas (manifestaciones fenotípicas solapadas) [18, 25-27]. Teniendo en cuenta estos criterios que son claramente aplicables al SA creemos que la mejor estrategia para profundizar en el síndrome y dar una respuesta a todas las familias que aún carecen de un diagnóstico es la utilización de la nueva tecnología de secuenciación.

Este proyecto es una continuación de los estudios que nuestro grupo ha llevado a término relacionados con la discapacidad intelectual idiopática y los síndromes de Prader-Willi y Angelman. El abordaje integral de estos síndromes es posible gracias a la Unidad de atención alos trastornos cognitivos de base genética implementada en nuestro hospital en 1997 en la que se atienden de forma multidisciplinar (neurólogos, genetista clínico, biólogos genetistas, endocrinólogos, psicólogos y psiquiatras) a los pacientes afectos de síndromes con base genética. Este proyecto es una excelente oportunidad para examinar exhaustivamente desde el punto de vista genético y clínico nuestra serie de pacientes con fenotipo SA sin diagnóstico molecular y dilucidar nuevos defectos genéticos que nos ayuden a esclarecer aspectos genotípicos, fenotípicos y clínicos hasta el momento aún poco definidos. A lo largo de estos últimos años venimos colaborando con distintos investigadores K Buiting (Institute of Human Genetics at theUniversity Hospital Essen), D. Monk (Imprinting and CancerGroup, IDIBELL, Barcelona), X. Estivill (Centre Regulació Genómica de Barcelona), F Martinez (Hospital La Fé Valencia).

 

HIPOTESIS
- La tecnología de NGS del exoma ha identificado nuevos genes en patología mendeliana del neurodesarrollo definiendo nuevos síndromes. Su aplicación puede ayudar a dilucidar nuevas alteraciones genéticas en uno o dos genes en aquellos pacientes con fenotipo SA que carezcan en la actualidad de un diagnóstico molecular.

- Mutaciones en otros genes cuya función interactúa en vías comunes con el gen UBE3A evidencia nuevas vías moleculares implicadas en la expresión del fenotipo SA.

- Se hallan diferencias en cuanto al desarrollo de habilidades adaptativas respecto a pacientes sin diagnóstico molecular y pacientes con mutación en UBE3A.

 

OBJECTIVOS
Avanzar en el conocimiento de la etiopatogenia del SA identificando nuevas dianas genómicas para la mejora del diagnóstico, pronóstico y tratamiento.
· Identificar un nuevo gen/genes mediante el estudio del exoma por NGS que puedan serresponsable s del fenotipo SA en individuos con un diagnóstico molecular normal en el test de metilación del locus SNURF-SNRPN y en la secuenciación del gen UBE3A.
· Describir las redes de conexión molecular entre los nuevos gen/genes candidatos involucrados en el SA mediante el análisis de interacción génica.
· Definir el perfil neurocognitivo y de habilidades adaptativas en los pacientes con una mutación en un nuevo gen candidato y determinar si hay diferencias con el grupo de pacientes sin diagnóstico molecular y con el grupo de mutación en UBE3A.

 

METODOLGÍA


Diseño:
Estudio prospectivo clínico-genético de una serie de pacientes SA de causa desconocida con resultados normales en el test de metilación específico en el locus SNRPN y en el estudio mutacional del gen UBE3A.
Se procederá a realizar una exploración clínica, neurológica y psicológica minuciosa siguiendo los protocolos clínicos diseñados en la Unidad de atención a personas con trastornos cognitivos conductuales de base genética de la Corporació Sanitària Universitària Parc Taulí.

Sujetos de estudio:
Se seleccionarán una serie de 10 pacientes de una cohorte de 80 registrados en nuestra casuística que cumplan los criterios de inclusión descritos por Williams y colaboradores (Williams et al., 1995) revisados en 2005 por los mismos autores con la colaboración del cientific Advisory Committee of the US Angelman Síndrome Foundation (Williams et al., 2006). Se ampliará el estudio de las variantes candidatas mediante secuenciación Sanger en 15 individuos que cumplan los criterios de inclusión y en 100 controles sanos.

Una vez finalizado el estudio se facilitará un informe con el resultado a cada uno de los participantes.

 

Recogida de datos
Desde la Unidad de atención a personas con trastornos cognitivos conductuales de base genética de nuestro hospital se programarán las consultas de genética clínica, neurología y psicología.

- Variables clínicas: recogida de variables demográficas y clínicas relacionadas con el período perinatal/lactante, características físicas y fenotipo conductual característico
- Cuestionarios neuropsicológicos:
§ ICAP inventario para la Planificación de Servicios y Programación Individual. Versión y adaptación española de Delfín Montero (Universidad de Deusto). El ICAP se compone de un registro sistemático de datos relevantes sobre la persona atendida por un servicio y de dos instrumentos normativos de medida, uno de conducta adaptativa y el otro de problemas de conducta. El ICAP es aplicable a personas de todas las edades y fundamentalmente está pensado para ser utilizado en personas con discapacidades.
§ "BayleyScales of Infant and Toddler Development, Third Edition" inicialmente pensado para niños con edades hasta los 42 meses, permite obtener en personas con discapacidad intelectual una edad equivalente de desarrollo tanto a nivel cognitivo como de lenguaje y motriz
§ Observación de habilidades de comunicación y registro pre-verbal y de conducta ad hoc.


Análisis genéticos
Obtención de muestra de ADN a partir de extracción de sangre de los pacientes y sus progenitores siguiendo el protocolo establecido en el laboratorio.
La Secuenciación del exoma se llevará a cabo en trios paciente-progenitores mediante métodos de captura selectiva y enriquecimiento de las regiones diana con kits SureSelect Human All Exon (Agilent) o SeqCap EZ Human Exome Library (NimbleGen). Esta tecnología permite la secuenciación de >99% de exones del genoma y la detección de variantes codificantes relevantes.

Se identificarán como posibles variantes patogénicas sólo aquellas variantes que puedan provocar un cambio funcional severo en la proteína (cambios sin sentido, cambios de pauta de lectura, cambios en las secuencias consenso de splicing) o bien un cambio de aminoácido que no se encuentre en la población control. También se tendrán en cuenta las CNVs observadas.

El análisis de los datos derivados proporciona las variantes patológicas candidatas tipo SNVs o CNVs (copy number variant) que se confirmarán con otras técnicas como la secuenciación Sanger y la multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) respectivamente, en pacientes y progenitores.

La secuenciación Sanger de las variantes candidatas se realizará en 15 individuos afectados y 100 controles sanos.

 

Análisis de datos:
Todos los datos clínicos y genéticos de los pacientes se recogerán en un formulario protocolizado y se introducirán en una plantilla diseñada para este estudio en una base de datos Access.
Una vez finalizada la recogida de todos los datos de secuenciación exómica se procederá al siguiente análisis:
· Evaluación de los genes implicados en las nuevas dianas detectadas mediante secuenciación del exoma en pacientes SA.
· Identificación de posibles redes moleculares de interacción entre proteínas así como el posible enriquecimiento de alteraciones genéticas en una red concreta o función del organismo. 

Las variantes candidatas serán analizadas en 15 individuos afectos y en población control. Los resultados obtenidos permitirán:
· Realizar una correlación del fenotipo físico, neurológico y conductual cuando haya al menos tres casos con el mismo gen alterado.
· Determinar la patogenicidad de las variantes mediantes comparación población afectapoblación control.
· Se identificarán las diferencias con el grupo sin mutación conocida y con el grupo con alterción en UBE3A.

Bases de datos
Análisis variantes:

- Alineamiento de secuencias: SOAP, BWA, GEM y Samtools
- Detección de variantes: GATK UnifiedGenotyper
Interpretación:
- Anotación de variantes y predicción de patogenicidad: SnpEff, ANNOVAR, PoliPhen.
- Base de datos de desequilibrios genómicos/correlación genotipo-fenotipo: DECIPHER, ISCA, CARTAGINIA, Database of Genomic Variants, OMIM, UCSC.
Confirmación variantes patogénicas:
- Diseño de primers de MLPA: ProSeek,
- Información básica y funcional de los genes incluidos en CNVs o SNPs, interacciones moleculares y químicas, fenotipos celulares y procesos patológicos: IngenuityPathwaysAnalysis (IPA) software, Ingenuitysystems.
Análisis de redes moleculares:
- Redes de interacción entre proteínas: STRING, Ingenuity, KEEG
- Enriquecimiento de alteraciones en redes o funciones biológicas. Gene Ontology, David Bioinformatics Resources. (Huang DW et al., 2009).

EXPERIENCIA DEL EQUIPO
La investigadora principal de este Proyecto, Dra. M. Guitart, jefe de Sección de Genética del servicio de Laboratorio de la Corporación Sanitaria Universitaria Parc Taulí (CSPT), hospital adscrito al Servicio Catalán de Salud de la Generalitat de Catalunya, lleva trabajando en genética clínica desde el 1980. Durante este periodo ha trabajado en el campo de la Genética asistencial: citogenética convencional y molecular, genética molecular, diagnóstico prenatal y en consejo genético. Ha sido Investigadora Principal de diversos proyectos FIS, Redes temáticas de Investigación cooperativa como el Grupo de Investigación en Retraso Mental de Origen Genético, la Plataforma de genotipación para la identificación de factores genéticos implicados en la susceptibilidad y en la respuesta farmacológica de las Enfermedades mentales, y en la Red Epidemiológica de Investigación en Enfermedades Raras, REpiER. Ha sido y es investigadora de diversos proyectos de investigación en el ámbito estatal. Es autora de mas de 60 publicaciones nacionales e internacionales, también dentro de su trayectoria profesional consta su colaboración como ponente en Congresos y Jornadas especializadas en Genética. Ha sido organizadora decuatro simposios nacionales. Ha sido vocal de la Asociación Española de Diagnóstico prenatal durante los años 2002-2006.


La Dra. Elisabeth Gabau médico pediatra desarrolla su actividad profesional desde hace 30 años en el campo de la Genética clínica. Es miembro de la Sociedad de Genética Clínica y Dismorfología de la Asociación Española de Pediatría. Es de destacar su experiencia en el retraso mental de origen genético y es la responsable de la Unidad de Atención a Personas con Trastornos Cognitivos Conductuales de base genética de la Corporación ParcTaulí.

Se han desarrollado distintas líneas de investigación en la actualidad vigentes que nos han proporcionado experiencia en distintos campos:
1. Evaluación clínica y molecular de los síndromes de PraderWilli y Angelman. Producción científica: 12 publicaciones indexadas. En la actualidad estamos estudiando la conectividad funcional cerebral en las redes de motivación para la comida en pacientes adultos con SPW.Se han organizado tres simposios nacionales.
2. Estudio de variantes estructurales genómicas asociadas a trastornos psiquiátricos.I) Se han descrito algunos genes candidatos susceptibles de esquizofrenia. II) Estudio clínico-genético del síndrome velocardiofacial. Producción científica: 8 publicaciones indexadas.
3. Estudio del retraso mental de origen genético. El estudio de la discapacidad intelectual en la infancia y en adultos ha sido tratado desde la vertiente asistencial y investigadora. M.Guitart pertenece a la junta de la Asociación GIRMOGEN: Grupo de Investigación en Retraso Mental de Origen Genético. Producción científica: 9 publicaciones indexadas.


El resto del equipo investigador ha desarrollado su experiencia profesional en los campos deldiagn óstico genético, y diagnóstico clínico, cabe destacar a Dra. Carme Brun pionera en España del desarrollo del fenotipo conductual, ha colaborado en proyectos de investigación y poseen publicaciones. La experiencia de todo el grupo, que incluye tanto profesionales clínicos como de laboratorio, es una garantía de éxito para la consecución de este proyecto de investigación.

Para el análisis e interpretación de los datos de secuenciación del exoma este proyecto consta con el soporte de la Dra. Raquel Rabionet, del Centro de Regulación Genómica (Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona), experta en tecnología de nueva generación. Desde 2011 colaboramos con el grupo del CRG en el estudio de secuenciación del exoma en pacientes afectados de discapacidad Intelectual i trastornos psiquiátricos. Se han presentado cuatro comunicaciones en congresos internacionales.

MARCO ESTRATÉGICO
Nuestro proyecto tiene capacidad de abordar los objetivos propuestos dado que disponemos de una de las series más largas a nivel nacional (112 casos con diagnóstico molecular de SA) conseguida desde el año 1996 y somos centro de referencia de la Asociación de padres del SA, 2) tenemos experiencia en el manejo clínico-conductual de pacientes con trastornos del neurodesarrollo y 3) estamos familiarizados con la tecnología molecular de secuenciación masiva.


Nuestro proyecto propone una metodología basada en la utilización de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva que abre muchas posibilidades a la identificación de pacientes con nuevas mutaciones y que nos permite una profunda comprensión de los aspectos clínicogenéticos. Llegar a un diagnóstico permitirá ofrecer a los padres un consejo genético, un pronóstico preciso y plantear las debidas pautas de tratamiento. Una aplicación importante de
nuestro proyecto es contribuir al desarrollo de un algoritmo diagnóstico basado en las nuevas tecnologías genómicas como es la secuenciación masiva. La búsqueda de una red de s genes como base etiológica de los procesos fisiopatológicos en los problemas de salud es también la finalidad de nuestro proyecto, la posibilidad de encontrar distintos genes que interaccionen en una vía molecular común abrirá nuevas posibilidades para el ensayo de nuevas terapias farmacológicas para el SA.


Creemos que la cooperación entre los investigadores clínicos de las unidades que atienden a los pacientes y los investigadores moleculares dará resultados altamente positivos como numerosas publicaciones en revistas internacionales y nuevas aplicaciones diagnósticas que facilitarán una traslación inmediata de los conocimientos en el ámbito clínico para dar mayor soporte a las familias y mejorar el manejo del paciente. La colaboración con dos centros de investigación punteros contribuirá a potenciar las sinergias entre los campos de la genómica y el clínico. El análisis bioinformático se realizará en colaboración con el Centro de Regulación Genómica con experiencia en el desarrollo de nuevas aplicaciones para la investigación genética. La aplicación de la secuenciación masiva en el ámbito de la identificación de nuevos genes asociados a enfermedades neurocognitivas minoritarias es todavía un campo en desarrollo. Forma parte de nuestro interés valorar la posibilidad de integrar la secuenciación masiva en nuestra rutina asistencial. El análisis de las interacciones génicas puede abrir grandes perspectivas a una comprensión global de la enfermedad y su Funcionamiento. El conocimiento de los genes que intervienen en la red neurogenética del SA nos permitirá diagnosticar con exactitud pacientes sinetiología molecular conocida, además de posib ilitar la creación de nuevos modelos murinos paranuevas investigaciones de dianas terapéuticas tanto para el SA como para sintomatologías compartidas con otras enfermedades.

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